Enzimas proteasas

Este artículo recoge la conferencia impartida por la Dra. Sara Borrell, del equipo de Registros de Biovet, en el XXXI Simposium Internacional de Biovet en Tarragona, durante la cuarta sesión dedicada a las enzimas y los captadores de micotoxinas, que tuvo lugar el día 29 de mayo de 2018. Bajo el título, “Enzimas proteasas. Revisión e importancia económica” la conferencia profundizó en el estudio de las proteasas describiendo los diferentes tipos, el mecanismo de acción, los métodos de análisis y usos, etc. La veterinaria del equipo de Biovet S.A, Dra. Maria Soriano, ha realizado la adaptación de la ponencia.

ENZIMAS: Definición, unidades y clasificación

En toda reacción química existen diferentes reactivos (A + BC) transformados posteriormente en diferentes productos (AB + C), que constan de un paso intermedio llamado estado de transición o estado de activación (A-B-C), en el que los enlaces de los reactivos se encuentran debilitados para poder ser modificados. Este estado de transición posee una energía superior a la de los reactivos y a la de los productos, por lo que es necesario un aporte energético llamado energía de activación (Ea) para que la reacción se lleve a cabo.

Las enzimas son biocatalizadores eficientes y específicos que impulsan estas reacciones biológicas, aumentando la velocidad de reacción por disminución de la energía de activación (Imagen 1). Estos catalizadores permiten, a bajas cantidades y sin consumirse, alcanzar el equilibrio de la reacción química más fácilmente sin alterar el resto de los parámetros energéticos de la reacción.

Las reacciones enzimáticas son regulables y la mayoría de las enzimas son proteínas.

La actividad enzimática se mide según la velocidad de desaparición del substrato o la velocidad de aparición del producto. La actividad enzimática puede expresarse en:

• Unidades internacionales de actividad enzimática (UI): en referencia a la cantidad de enzima necesaria en condiciones óptimas de temperatura, pH y fuerza iónica para transformar 1 µmol de sustrato por minuto.
• Katal: en relación a la cantidad de enzima que se requiere en condiciones óptimas para transformar 1 mol de sustrato por segundo. La equivalencia entre ambas unidades es de: 6×107 IU = 1 katal.

En el ámbito industrial no suelen utilizarse estas unidades y, por ejemplo, en el caso de las proteasas, existen diversas unidades aceptadas en el ejercicio práctico, tales como: unidades King- Amstrong, unidades Bodansky, unidades Somogyi o unidades Anson. Estas últimas unidades, las unidades Anson para la actividad peptídica, describen la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar 1 mmol de tirosina con hemoglobina como sustrato en 10 minutos, correspondiendo 1 unidad Anson a 550 UI.

Las enzimas se clasifican de acuerdo con la Comisión de enzimas con la nomenclatura “EC a.b.c.d”, donde:

• a: Clase, relacionado con la reacción que se cataliza (Tabla 1)
• b: Subclase
• c: Sub-subclase
• d: Número de serie de la sub-subclase

PROTEASAS: Tipos, mecanismo de acción, métodos de análisis y usos

Para poder obtener los aminoácidos esenciales presentes en la dieta, normalmente incluidos en proteínas más complejas, es necesario descomponerlas mediante el uso de enzimas específicas, llamadas proteasas.

De acuerdo con la Comisión de Enzimas, las proteasas se incluyen en el grupo 3 de hidrolasas porque su mecanismo de acción es la ruptura de los enlaces peptídicos de las proteínas mediante el uso de una molécula de agua, obteniendo como productos péptidos más sencillos o aminoácidos (Imagen 2).

Imagen 2 – Proceso de hidrólisis llevado a cabo por una proteasa.

Las proteasas se clasifican según diversos criterios como:

• Origen: animal, vegetal, bacteriano o fúngico.
• Modo de acción catalítico: actividad endógena o exógena, dependiendo de si rompen los enlaces peptídicos situados en los extremos o en el interior de la cadena peptídica.
• Según el aminoácido presente en centro activo, encargado de catalizar la reacción:
  • Serina proteasas
  • Cisteína proteasas
  • Aspartato proteasas
  • Metaloproteasas

El centro activo de la enzima es el lugar por donde se une el sustrato y donde tiene lugar la catálisis de la reacción (Imagen 3). El centro activo es de tamaño muy pequeño respecto al tamaño total del enzima y está compuesto por una cadena lateral de aminoácidos que se unen al producto y una cadena lateral de aminoácidos que realizan la catálisis.

Imagen 3 – Centro activo de una enzima.

Para explicar con más detalle como realizan el proceso de hidrólisis las proteasas, se muestra como ejemplo el mecanismo de acción de una serina proteasa (Imágenes 4, 5, 6, 7 y 8).

MECANISMO DE ACCIÓN DE UNA SERINA PROTEASA

El mecanismo de acción de una serina proteasa consiste en una fase de acilación en la que se forma un intermediario covalente acil-enzima, con liberación del primer producto, y una fase de desacilación en la que una molécula de agua rompe el intermediario con liberación del segundo producto.

El espacio de color negro en las imágenes es la representación del centro activo de la enzima, donde aparecen inicialmente (Imagen 4):

• La tríada de los tres aminoácidos unidos, que son serina (Ser 195), histidina (His 57) y aspartato (Asp 102), común en todos los centros activos de las serinas proteasas.
• La proteína que va a ser hidrolizada, presente en la parte inferior izquierda de la imagen.

La acción catalítica comienza cuando His 57 retira un protón del grupo alcohólico de la serina, quedando la histidina con carga positiva y la serina con carga negativa. Esta serina es la que se relaciona inicialmente con la proteína, atacando al grupo carbonilo (C=O) del enlace escindible, y dando lugar al Estado de transición 1 (fase de acilación, imagen 5).

A continuación, la histidina 57 cede su protón a este complejo, con lo que se separa el primer producto (NH2-R) y el complejo queda como Acilenzima (Imagen 6), listo para comenzar la segunda fase de la reacción.

La segunda fase de la reacción tiene lugar por la entrada de una molécula de agua (el segundo substrato) al centro activo. La histidina 57 retira entonces un protón de la molécula de agua, que queda convertida en un ion hidroxilo (OH–) unido a la acilenzima y la serina (Imagen 

El grupo hidroxilo ataca nuevamente al enlace carbonilo, produciendo el segundo estado de transición, que se resuelve con la salida del producto 2. Por último, la histidina cede su protón a la serina, con lo cual tiene lugar la vuelta al estado inicial del centro activo (Imagen 

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Existen tres métodos para la cuantificación de enzimas:

• ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): Basado en la capacidad del enzima para unirse a un sustrato, en este caso anticuerpos. Esta unión dará lugar a un producto coloreado, así que la intensidad de color es proporcional a la cantidad de enzima.

• ELECTROFORESIS: Técnica basada en la separación de moléculas en base a su tamaño y su carga eléctrica. Consiste en un gel (de agar o poliacrimida) colocado en una cámara sometida a una diferencia de potencial causada por un cátodo (terminal con carga negativa) y un ánodo (terminal con carga positiva) en los lados opuestos de la cámara. El campo eléctrico que se crea provoca la migración de las moléculas: moléculas grandes y pesadas migrarán más lentamente que moléculas pequeñas y 

• ESPECTROFOTOMETRÍA: Se basa en el principio de formación de un complejo coloreado cuando contactan enzima y sustrato en presencia de los reactivos adecuados. La absorbancia emitida por este complejo se mide y permite realizar una recta de calibración con los patrones de la enzima.

USOS

La proteína de origen animal se ha convertido en un elemento de la dieta con un elevado costo y con muchas fluctuaciones en el suministro. Por ello, la proteína vegetal se ha convertido en la fuente alternativa, especialmente las legumbres, compuestas por proteína de alta calidad, vitaminas, fósforo y hierro, con la desventaja de contener factores antinutricionales como los inhibidores de proteasas, que interfieren en el uso digestivo y metabólico de las proteínas de la dieta o los inhibidores de glicosidasas, especialmente la α-amylasa de la soja.

Al aumentar el uso de la proteína de origen vegetal, se ha extendido la inclusión de proteasas en la dieta. El uso de una proteasa eficiente permite:

• Mejorar la digestibilidad de las proteínas y los aminoácidos de la dieta, que se refleja en un mejor índice de conversión, en una disminución de la excreción de nitrógeno al medio ambiente y una reducción de los casos de clostridiosis intestinal.
• Compensar los factores antinutricionales.

La selección de la proteasa en la dieta debe tener como consideraciones:

• La especie de destino.
• La especificidad por un sustrato a mayor rango de acción.
• Las condiciones fisiológicas: por ejemplo, el pH en los diferentes tramos digestivos.
• La encapsulación de las semillas vegetales.
• La estabilidad durante la fabricación, y su resistencia al calor durante el procesado.
• La sinergia con otras enzimas usadas.

IMPORTANCIA ECONÓMICA

Las proteasas generaron unas ventas de 150 millones de dólares en 2016, lo que supone un 15% del total del mercado de las enzimas. La Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE) prevé un crecimiento del mercado de este tipo de enzimas para los próximos años, a nivel mundial alrededor de los 1280 millones USD en 2019 y de los 2000 

CONCLUSIONES

La demanda creciente de proteínas y aminoácidos necesarios en la dieta de animales de producción para alcanzar las conversiones que la industria necesita es un factor clave para soportar la penetración de las proteasas en los mercados de enzimas.

Mejorar la eficiencia de la alimentación manteniendo la salud intestinal es la propiedad más beneficiosa de las proteasas.

Uso de Acidificantes en la Industria Porcina

• 
• La acidificación no es un concepto nuevo en dietas para cerdos. Su objetivo principal es el de auxiliar a los animales a mantener un pH óptimo en el estómago, permitiendo una activación y funcionamiento correctos de enzimas proteolíticas en el estómago.
• Su uso comienza desde las primeras fases de alimentación (Lechones). Los lechones presentan una capacidad limitada de producir ácido clorhídrico en el estómago. Cuando proteínas de origen vegetal, en vez de proteínas lácteas son ofrecidas, el pH óptimo de actividad de la pepsina no es alcanzado. La actividad proteolítica inicial por acción de la pepsina es necesaria para que ocurra la actividad subsiguiente de la tripsina en el intestino delgado.  Cuando el alimento no digerido llegue al intestino delgado, las bacterias lo utilizan.
• Por lo tanto, cuando la acidificación apropiada es alcanzada, ocurre una doble acción contra microorganismos patogénicos: una protección directa al reducir el pH, lo que favorece el desarrollo de bacterias no patogénicas y una reducción en la cantidad de substrato para bacterias patogénicas.
• Los efectos positivos de la adición de ácidos orgánicos o de sus sales sobre los rendimientos de lechones han sido demostrados en numerosas ocasiones desde el año de 1988.
• El efecto promotor del crecimiento de los ácidos orgánicos es particularmente evidente en las semanas que siguen al destete. Lechones destetados a las 3-4 semanas de edad manifiestan a menudo una baja ganancia de peso, bajo consumo y diarrea, lo que puede ser el resultado de un desarrollo incompleto del aparato digestivo.
• La acidificación de la dieta reduce su capacidad tampón y puede facilitar la digestión gástrica de la proteína y aumentar su digestibilidad. Por otro lado, sales orgánicas neutras, como el formato sódico o cálcico mejoran los rendimientos sin afectar marcadamente la acidez. Por tanto, los beneficios de la inclusión de ácidos orgánicos pueden ser atribuidos a las propiedades antimicrobianas del anión ácido que, tal como se ha demostrado para el ácido fórmico, controla eficazmente la población microbiana en los primeros tramos del intestino delgado

Metabolismo hepático y niveles de fármaco en sangre

Para simplificar vamos a centrarnos solo en el metabolismo hepático de fármacos en relación con los polimorfismos genéticos y no vamos a entrar en los mecanismos de transporte a través de membranas y la acción por unión con el receptor en el órgano diana, aunque conceptualmente el resultado es el mismo, más actividad o menos actividad, es decir más absorción a través de una membrana de un fármaco o más salida del fármaco del interior de una célula al exterior, más unión al receptor más efecto terapéutico, menos unión al receptor menos efecto terapéutico. Y todo ello producido por un fármaco que se une por una unión “llave-cerradura” a una proteína específica.

La estructura de una enzima (y en general de una proteína) viene definida por un gen y en nuestro organismo se han tipificado unos 25.000 genes. De éstos en la actualidad se conoce que no más de unos 30 intervienen en el metabolismo hepático de fármacos. En los genes tenemos polimorfismos y éstos pueden afectar (o no) a la actividad de las enzimas que codifican. Se están detectando muchos polimorfismos en la mayoría de genes, pero afortunadamente la mayoría de ellos no provocan ningún cambio funcional en la proteína codificada, por lo que no tiene ningún interés su estudio en la práctica clínica. En el caso de que la modifiquen, estos polimorfismos entran a formar parte del conjunto a estudiar en aplicaciones farmacogenéticas, considerando también cuál es su incidencia en la población y no se tienen en cuenta si su incidencia es inferior al 2-3% de la población, esto varía según etnias.

Recordemos que de cada gen tenemos dos copias que son los alelos; uno lo tenemos de herencia paterna y otro de herencia materna. Las personas que de un gen tienen los dos alelos de estructura “ancestral” que es la mayoritaria en la población se considera la “normal”, pues es la que en los ensayos clínicos manifestará la mayoría de la población se resume también con las letras wt, del inglés wild type o “tipo salvaje”; estos pacientes metabolizarán el medicamento de la forma prevista y se designan utilizando la nomenclatura internacional de fenotipo EM o Extensive Metabolizers. Pero una parte importante de la población puede tener un alelo mutado, cuya mutación haga que cambie la estructura de la enzima y no tenga actividad; estas personas tendrán solamente un alelo activo, por tanto producirán la mitad de enzima estructuralmente funcional, la mitad de actividad y por tanto, a grandes rasgos (hay muchos trabajos que definen más este concepto de forma individualizada), necesitarán para el mismo efecto la mitad de la dosis. En este caso, hablaremos de personas de fenotipo IM o Intermediate Metabolizers. Pero se pueden heredar dos alelos no funcionales –iguales o diferentes- y entonces no habrá prácticamente síntesis de enzima funcional (hay actividades residuales que van del 1 al 10%). En estos casos no debe prescribirse el medicamento por alto riesgo de efectos de sobredosis y debe recomendarse un medicamento de acción farmacológica similar pero que se metabolice por otra enzima en cuyo gen el paciente no tenga ningún polimorfismo anómalo. En este caso hablamos de fenotipo PM o Poor Metabolizers. Pero también pueden haber pacientes EM que tengan duplicaciones o más repeticiones del gen y entonces se producirá mucha más cantidad de la enzima (hay varias “cadenas de producción”) y por lo tanto los medicamentos se metabolizarán muy rápidamente. Se dice que su fenotipo es UM o Ultrarapid Metabolizer y habrá fracaso terapéutico. Lo recomendable en estos casos es cambiar de medicamento del mismo efecto terapéutico y que no se metabolice por esta enzima.

El objetivo para un éxito terapéutico es mantener los niveles en sangre dentro de un intervalo llamado “ventana terapéutica”. Concentraciones plasmáticas dentro de este intervalo producen la acción terapéutica deseada, por debajo puede haber fracaso terapéutico y por encima efectos adversos por sobredosis. El medicamento se absorbe, alcanza según la dosis un nivel máximo –en general a las 2-3 horas- y va descendiendo;  Cuando llega a una concentración subterapéutica hay que dar otra dosis, y esta es la explicación del porqué hay que tomar una dosis cada seis, cada ocho, cada 12 o cada 24 horas, según la posología recomendada en el folleto; esta gráfica de concentraciones plasmáticas en función del tiempo es lo que se conoce como farmacocinética del fármaco. 

Si la dosis calculada para la mayoría de la población, es decir de fenotipo EM, se administra a un paciente IM, paulatinamente se irán alcanzando niveles más altos, pues el ritmo de eliminación será menor: en estos casos es recomendable disminuir la dosis entre un 30-50% aunque, a veces, si la ventana terapéutica es amplia, pueden obtenerse resultados satisfactorios al ser una ligera “sobredosis”; esto se tiene que concretar para cada medicamento. Pero si el fenotipo del paciente es PM, el medicamento prácticamente no se eliminará. Cada intervalo de horas definido tomaremos una nueva dosis, cuando la anterior todavía no se eliminado y tendremos un efecto aditivo y así cada 6, 8 o 12 horas, y al cabo de una semana estaremos en niveles de sobredosis y aparecerán ya los efectos adversos. Por el contrario si el paciente es de fenotipo UM, el fármaco se eliminará muy rápidamente y en los intervalos interdosis el paciente estará muchas horas con niveles subterapéuticos.

Por lo tanto el conocer, a través del estudio de polimorfismos genéticos, el fenotipo del paciente, sabremos de forma personalizada si este paciente necesita la dosis del protocolo, si necesita la mitad o si es mejor cambiar a otro medicamento con la misma acción terapéutica, pero que no se metabolice a través de esta enzima sino por otra para la que el paciente sea de fenotipo EM. 

Uso de Echinacea sp.en alimentación animal

LA PLANTA
Echinacea sp. es un género que comprende nueve especies de plantas herbáceas de la familia Asteraceae. Todas son endémicas de las zonas este y centro de América del Norte, donde se encuentran creciendo en praderas húmedas y secas y en claros de zonas boscosas. Se trata de flores compuestas que florece desde principios a finales del verano. El nombre del género de proviene del griego “echino”, que significa "espinoso", debido al disco central espinoso. Algunas especies se utilizan como plantas medicinales y otras son cultivadas como ornamentales por sus vistosas flores.

PRONUTRIENTES
La mayoría de los extractos se obtienen a partir de partes aéreas o raíces de Echinacea purpurea, o bien de las raíces de E. angustifolia o E. pallida. Los pronutrientes más importantes son los derivados del ácido cafeico (ácido cicórico, equinacósido), polifenoles equinócidos, alcamidas, poliacetilenos y glicoproteínas/polisacáridos.

Actividad como potenciador de la inmunidad:

• El extracto de Echinacea activa la vía alternativa del complemento mediante el aumento de los recuentos de granulocitos y de leucocitos. Promueve la quimiotaxis de los monocitos, neutraliza los virus y causa bacteriólisis.
• Sus pronutrientes interaccionan con los hidratos de carbono de los receptores de la superficie de los linfocitos T y los macrófagos, produciendo efectos inmunoestimulantes. También aumentan la fagocitosis producida por macrófagos y estimulan a los mismos para producir una mayor cantidad de factor de necrosis tumoral, interferón y interleuquina-1. Promueve la destrucción de las células tumorales.
• El extracto de Echinacea promueve la activación no-específica de células T, su producción de interferón y la secreción de linfocinas.

USO EN AVES
Ponedoras: La Echinacea estimula el sistema inmunológico, mejora del recuento de linfocitos, la tasa de fagocitosis (p <0,02), y el título de anticuerpos tras la vacunación de Newcastle. La aplicación intermitente de E. purpurea en la alimentación de las ponedoras incrementa el número de linfocitos y leucocitos totales.
Pollos de engorde: El uso de Echinacea se traduce en una mayor de ganancia diaria de peso, una reducción de la mortalidad y una mejora significativa de anticuerpos en suero, por lo tanto, contribuye a un mejor índice de conversión del alimento.

USO EN PORCINO
La Echinacea ha sido utilizada en las cerdas, lechones y cerdos de engorde. Preparaciones a base de E. purpurea se han reportado para mejorar la salud porcina, el rendimiento y la calidad de la carne.
La suplementación de E. purpurea en dietas para cerdos mejora la ganancia de peso y el índice de conversión, reduce la incidencia de diarreas y también disminuye los niveles de colesterol en la sangre.
Además, se ha demostrado que aumenta la respuesta inmune tras la vacunación, al incrementar el recuento de linfocitos y la tasa de fagocitosis.

BOVINOS
E. purpurea es capaz de aumentar la capacidad de los PMN a matar a las células diana. Suplementación con Echinacea lleva un efecto positivo de la función inmunitaria en los terneros en transición.

CABALLOS
La Echinacea se utiliza también como estimulante inmunológico para complementar un sistema inmunológico saludable de los caballos. La mejor manera de usar Echinacea es complementar a las primeras señales de enfermedad o infección. Administración de Echinacea también aumenta el número de glóbulos rojos y hemoglobina, mostrando su efecto sobre el mecanismo de transporte de oxígeno.

BAJA TOXICIDAD
La toxicidad de Echinacea sp. parece ser muy baja. Los resultados de experimentos con diferentes preparaciones y productos de Echinacea sp. en diversas especies de ganado no muestran ningún efecto negativo ni signos de toxicidad. No hubo efecto negativo de la suplementación con jugo de E. purpúrea en el rendimiento, así como las funciones del hígado en pollos de engorde.

CONCLUSIÓN

La Echinacea es una de las pocas hierbas que han sido ampliamente investigadas. Las investigaciones actuales sobre el uso de E. purpúrea en el ganado siguen siendo limitadas, pero los resultados disponibles indican efectos positivos en términos de aumento de peso y calidad de la carne, que mejoró en aves y cerdos. La estimulación del sistema inmune se ha observado también en bovinos, equinos, aves de corral y cerdos.

Pronutrientes en nutrición animal, ¿por qué?

En respuesta a estas crisis, la Unión Europea diseñó un sistema de seguridad y transparencia que engloba toda la cadena alimentaria europea y estableció una amplia legislación, que destaca la responsabilidad de los productores y los proveedores. En este marco, en 2006 se prohibió el uso de los antibióticos promotores del crecimiento.

Todo esto ha llevado a diseñar estrategias de producción seguras y saludables para el animal y para el consumidor final, combinando prácticas de nutrición y manejo. Dentro de estas nuevas estrategias de nutrición, la inclusión en el alimento de extractos de plantas ricos en pronutrientes es una de las tendencias más al alza, por sus buenos resultados y su seguridad.

Según Gordon Rosen, creador del concepto en los años 50, un pronutriente es un microingrediente que añadido al alimento en cantidades relativamente pequeñas es capaz de mejorar el funcionamiento fisiológico, aumentar el valor nutricional intrínseco y evitar la presencia de patógenos. Son moléculas complejas de origen vegetal que regulan y estimulan el metabolismo sin tener acción farmacológica y pueden tener actividad sobre uno o más órganos, aparatos o sistemas del animal.

Utilizar extractos de plantas de contenido en pronutrientes estandarizado, profundizar en sus mecanismos de acción y evaluar científicamente los resultados zootécnicos que produce su inclusión constituyen el camino para lograr un alimento seguro, saludable, que satisface las necesidades del consumidor y con el que se obtienen los resultados productivos esperados.

En resumen, el aumento de la población mundial, la mejora de la renta per capita en muchos países y la progresiva migración hacia las ciudades hacen prever un periodo de crecimiento de la avicultura y de la ganadería para los próximos años. El consumo de carne en los mercados desarrollados está enfocado en menor medida hacia el precio y más hacia la calidad, la seguridad y las preferencias del consumidor. Aunque esta tendencia todavía no ha llegado a muchos países emergentes, que no cuentan con legislaciones restrictivas, estoy convencida que la globalización en la producción de carne y la progresiva concienciación de los consumidores empujaran al mercado mundial en este sentido y en unos años la utilización de pronutrientes en alimentación animal estará generalizada.

La Biotecnología: Mejora la digestibilidad del alimento

Las bondades que ofrece la biotecnología a la sanidad animal son las enzimas. ¿Que son las enzimas?­­, son proteínas que actúan como aceleradores de las reacciones químicas, de síntesis y degradación de compuestos. Tiene elevada especificidad, por lo que cada tipo de enzima se une a un único tipo de sustancia, el sustrato, sobre el que actúa.

El uso adecuado de las enzimas, permite una mejora en el aprovechamiento de los elementos nutricionales de los granos, haciéndolo más asimilables por el aparato digestivo animal, permitiendo a su vez que los costos de producción disminuyan, y haciendo más rentable la actividad ganadera por los altos precios de los ingredientes de los piensos. Su uso nos permite mejorar el uso de nuestras materias primas, permitiendo utilizar otros ingredientes alternativos en nuestros países para hacer la actividad más rentable y no depender exclusivamente de materia prima externas, por lo tanto, mejora la eficiencia en la producción.

Hay diferentes formas de obtener enzimas: a) de tipo Animal como son la tripsina, lipasas y cuajos. b) de tipo Vegetal proteolíticas como la papaína, bromelina.  Pero la forma más abundante es la microbiana, donde las que más se emplean en alimentación animal, destaca las fitasas (60%), carbohidrasas (30%), lipasas y proteasas

 Las más utilizadas contra granos de cereales están las xilanasas (trigo) y b-glucanasas (cebada). Como mejoradores de la digestibilidad existen las enzimas con capacidad para hidrolizar los polisacáridos no almidón presentes en los cereales, tales como ß-glucanasas, xilanasas, arabinoxilanasas, celulasas, etc.

En el caso de las fitasas, esta enzima tiene capacidad para hidrolizar el fósforo fítico presente en los cereales, por lo que puede ser considerada como mejoradores de la digestibilidad, y del medio ambiente Tanto cerdos como aves pueden reducir la inclusión de fósforo inorgánico en las dietas y mantener los parámetros productivos, utilizando fitasas apropiadas.

Teniendo como base que unos de los componentes más caro que elevan los costos de producción, es la alimentación, la inclusión de las enzimas mejora la disponibilidad nutricional de los alimentos, mejorar la productividad ganadera a niveles muy económicos.  Su uso está muy ligado a la edad de los animales y de su aparato digestivo capaz de utilizar de forma más eficiente los nutrientes suministrados en los alimentos, para lograr producir animales en el menor tiempo posible con un mayor desarrollo y crecimiento.

 Todavía nos queda por investigar la relación del uso de las enzimas como mejorador de la digestibilidad y que efecto tiene sobre el desarrollo del intestino, junto a los pronutrientes y la mejora de la flora intestinal. Todos estos aspectos deben ser tomados en consideración por nutriólogos, universidades, ganaderos, industriales y empresas de elaboración de alimentos para sacar provecho de la biotecnología como mejorador de la producción, eficiencia, salud de los animales y de disponibilidad de alimento a costos atractivos a los consumidores.

Producción de proteína destinada a alimentación animal a partir de microorganismos

Este artículo recoge la conferencia titulada “Producción de proteína destinada a alimentación animal a partir de microorganismos”, impartida por la Prof. Dra. Mª de Àngels Calvo Torras, de la Facultad de Veterinaria, de la Universidad Autónoma de Barcelona (UAB) en la ceremonia de fin de curso académico de 2017.

Actualmente, uno de los mayores problemas con que se enfrenta el mundo es la tasa de crecimiento demográfico y en consecuencia es muy difícil que la agricultura convencional aporte la cantidad de alimento suficiente para una población tan numerosa. Por este motivo, la investigación de fuentes de proteínas ha motivado el desarrollo de nuevas técnicas agrícolas, para obtener cereales con elevado contenido proteico, e incluso la extracción de proteínas a partir de abocamientos líquidos mediante ultrafiltración.

Otra importante línea de investigación se basa en la producción y obtención del alto contenido de proteico, que puede aportar la biomasa microbiana. La capacidad de los microorganismos de crecer en varios sustratos ayuda a producir esta biomasa microbiana, conocida como proteína unicelular, con el desarrollo de microorganismos como bacterias, levaduras, algas y hongos, para la producción de alimentos para animales y para el hombre. El nombre de esta técnica hace referencia al estado unicelular o filamentoso de los microorganismos empleados para su producción, a diferencia de las proteínas obtenidas a partir de seres vivos pluricelulares, cómo son las plantas y los animales.

Desde hace mucho tiempo, el hombre ya había reconocido el valor nutritivo de determinados microorganismos, como son las levaduras y determinados hongos filamentosos.

A pesar de que la ingestión de proteínas procedentes de microorganismos no está aceptada por determinados consumidores debido a su sabor, no hay que olvidar que es una gran fuente de proteínas: mientras que a partir de 1.000Kg de soja, se producen diariamente 10Kg de proteína, la producción de proteína de 1.000Kg de bacterias llega hasta 100.000 millones de kilos. Esto es consecuencia principalmente del tiempo requerido para duplicar la masa de los microorganismos. Así, podemos decir que las bacterias y levaduras doblan su masa en un plazo de 20 a 120 minutos, a diferencia de las plantas de cultivo que tardan entre 1 a 2 semanas y, por ejemplo, de un cerdo que lo logra entre 4 y 6 semanas.

VENTAJAS 
La producción de proteínas por microorganismos tiene muchas ventajas, que podemos resumir, teniendo en cuenta que:

• En condiciones óptimas su tasa de crecimiento es muy rápida, pero son sensibles a los cambios de pH.
• La modificación genética de los microorganismos, en su caso, es más fácil que en el caso de plantas y animales.
• Las proteínas obtenidas a partir de microorganismos presentan un elevado valor nutritivo.
• Los microorganismos se pueden desarrollar en masa, es decir en grandes cantidades en contenedores relativamente pequeños.
• Los microorganismos son capaces de alimentarse de una amplia gama de productos de rechazo, y algunos son capaces de degradar incluso la celulosa de plantas.

Un aspecto fundamental es la selección y control de los microorganismos, puesto que no tienen que ser patógenos ni producir ni acumular compuestos tóxicos.

Entre los géneros de bacterias, más utilizadas para la producción de proteína podemos nombrar: Methylomonas, Pseudomonas, Bacillus y Aerobacter, por el hecho que son capaces de duplicarse en un periodo de 20 a 30 min y para tener un alto contenido de proteínas que puede llegar a un 85%. Entre las levaduras mencionaremos: Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromyces fragilis, empleadas tanto en la alimentación humana como animal. En relación a los hongos miceliales mencionaremos que crecen más lentamente que las bacterias y levaduras y entre las especies de elección podemos mencionar a: Paecilomyces variotii, Gliocladium deliquescens y Fusarium graminearum.

Los microorganismos utilizados en la producción de biomasa tienen que ser inoculados en medios favorables (esterilizado) y en condiciones nutricionales, que incluyen:
– Homogeneizar la materia delgada, de forma que le sea fácil al microorganismo metabolizarla o eliminar agentes inhibidores de crecimiento microbiano.
– Enriquecer el medio con nutrientes como sales nitrogenadas y fósforo, para que sirvan de fuente mineral.
– Ajustar el pH y la humedad del sustrato para favorecer el crecimiento de microorganismos involucrados.
– Aplicar tratamientos térmicos para eliminar los microorganismos patógenos de la matriz o materia prima.

DESVENTAJAS

• En ocasiones, la proteína obtenida no presenta las características de olor, textura y color.
• Se puede producir una digestión lenta o nula en el tracto digestivo del ser humano y en animales, especialmente en cuanto a las algas y esto puede ser causa de indigestión y/o reacciones alérgicas.

Otros productos de interés alimentario obtenidos a partir de microorganismos son: carbohidratos, grasas, vitaminas y minerales, así como aditivos alimentarios del tipo de aminoácidos.

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

Fermentaciones de subproductos agrícolas y despojos de matadero para sustituir la soja

Equipo de Investigación
El equipo está constituido por miembros de los grupos de investigación de la Universidad Autónoma de Barcelona (UAB):

• Grupo de Microbiología Aplicada y medioambiental del Departamento de Sanidad Anatomía Animales. Prof. Responsable Dra. M. Àngels Calvo.
• Grupo de Investigación en Rumiantes del Departamento de Ciencia Animal y de Alimentos. Prof. Responsable Dr. Gerardo Caja.
• Grupo de Compostaje de Residuos Sólidos Orgánicos del Departamento de Ingeniería Química. Prof. Responsable Dra. M. Teresa Gea.

MEMORIA
Antecedentes
El tratamiento de los residuos industriales representa un importante problema medioambiental debido a su volumen, y sus características físico-químicas. En los últimos años se han realizado un gran número de proyectos de investigación y publicaciones, que proponen dar un valor añadido a diferentes tipos de subproductos (Balandran-Quintana et. al., 2015; Jahurul et. al., 2015; Palumbo et. al., 2015). Se tiene que tener en cuenta que muchos de los residuos y subproductos industriales contienen hidratos de carbono (azúcares y fibra) y/o proteínas, que pueden ser aprovechados como sustratos, ya sea directamente o previas transformaciones biológicas, para obtener compuestos de alto valor en la alimentación animal (Bellaver et. al., 2005; Molina-Alcaide et. al., 2008; Molina-Alcaide y Yánez-Ruiz, 2008; Soto et. al., 2015).

A partir del estudio desarrollado el año anterior se pudieron seleccionar diferentes tipos de subproductos más adecuados para llevar a cabo la investigación que se plantea y también se han realizado estudios preliminares por la selección de grupos de microorganismos de interés en la consecución de las transformaciones deseadas.

La composición final de los productos obtenidos está condicionada al tipo de sustrato y a los inóculos utilizados, así como a las condiciones del proceso fermentativo, que está muy poco estudiado en el caso de los residuos agrícolas y agroalimentarios.

A partir de los primeros estudios realizados proponemos trabajar sobre residuos de frutas, residuos de la industria láctea, melazas y también sobre algas contaminados de canales de ríos y que dificultando el manejo del agua de los mismos de forma adecuada y su posterior eliminación cuando se retiran del curso de las aguas.

OBJETIVOS
El proyecto tiene como principales objetivos:

• Estudiar las características fermentativas y factores de optimización del proceso fermentativo, incluyendo inóculos microbianos innovadores, por su rentabilidad y la calidad de los productos obtenidos.
• Estudiar la composición y valoración nutritiva de los productos obtenidos para su utilización como suplementos proteicos destinados a la alimentación animal.

PLAN DE INVESTIGACIÓN

Actividad 1

Estudio de la Fermentación de los materiales seleccionados

En una primera fase se determinará el potencial de fermentación de los sustratos seleccionados, a escala de laboratorio y a temperatura controlada, en tubos de ensayo para hacer una primera selección, y posteriormente los que permitan obtener mejores resultados se desarrollarán sobre los sustratos seleccionados a diferente escala: matraz de 500ml y finalmente reactores de 1 L equipados con medida de presión para el cálculo del biogás producido (Ponsà et. al., 2011).

Como inóculos innovadores se utilizarán bacterias lácteas, levaduras y una mezcla constituida por bacterias lácteas, levaduras y bacterias fotótrofas. Se evaluará la mejora de la digestibilidad de los residuos y su poder nutritivo y, paralelamente, la producción de biogás, fuente de energía renovable.
Se compararán los resultados obtenidos con los diferentes microorganismos al desarrollarse sobre sustratos como, por ejemplo:
– Residuos de frutas: manzanas y naranjas
– Algas procedentes de los canales del Ebro y que representan una grave fuente de residuos, cuando se quieren eliminar
– Melazas
– Residuos de productos lácteos
– Residuos de mataderos
Se utilizarán cepas microbianas aisladas de diferentes sustratos (Ávila et. al., 2014). A partir del potencial de fermentación y las características de los residuos, se realizará la selección de los materiales, incluyendo la formulación de posibles mezclas.

En la formulación se tendrá en cuenta también la cantidad y estacionalidad con la cual se generan estos residuos. Una vez definidos los sustratos óptimos, se evaluará la fermentación de los mejores sustratos potenciales en biorreactores de mayor volumen (Maulini-Duran et. al., 2015).
Las muestras finales obtenidas se conservarán para su análisis a la Actividad 2.

Actividad 2

Estudio de la composición y valoración nutritiva de los productos obtenidos para su utilización como suplementos proteicos en alimentación animal

Se propone la evaluación de la capacidad nutritiva de las muestras obtenidas a la actividad anterior. Se procederá a determinar la composición química de las muestras siguiendo los esquemas clásicos de Weende y Van Soest (AOAC, 

Eficacia de los pronutrientes para incrementar la absorción de calcio en enterocitos

Este artículo recoge la conferencia impartida por la Dra. María Peñas, de Recombina Biotech, en el XXXI Simposium Internacional de Biovet en Tarragona, durante la tercera sesión dedicada a los pronutrientes, que tuvo lugar el día 28 de mayo de 2018. Bajo el título, “Evaluación de la capacidad de Alquernat Magacal para incrementar la absorción de calcio en enterocitos” la conferencia desgranó la eficacia de este producto, basado en pronutrientes, que mejora la absorción intestinal. El veterinario del equipo de Biovet S.A, Dr. Antón Tallero, ha realizado la adaptación de la ponencia.

INTRODUCCIÓN

Alquernat Magacal es un producto a base de pronutrientes, que son moléculas activas de origen botánico que mejoran la calidad de la cáscara y evitan la pérdida de hueso, al aumentar la absorción de calcio a nivel intestinal.

Así pues, Alquernat Magacal, ayuda a mantener niveles de calcio adecuados en gallinas ponedoras y reproductoras, en las que es común que ocurran deficiencias dando lugar a defectos en la calidad del huevo y óseas, como el síndrome de fatiga de jaula y fractura de huesos como la cabeza del fémur. Para conseguir esto, Alquernat Magacal actúa directamente en las células de la mucosa intestinal (enterocitos) incrementando la absorción intracelular de calcio.

Para demostrar su eficacia, se desarrolló un estudio in vitro en el laboratorio Recombina a finales de 2016, en el que se cuantifica la absorción de calcio de los enterocitos tras la adición de este producto diseñado por Biovet S.A.

OBJETIVO

Evaluar el efecto de Alquernat Magacal sobre la absorción de calcio midiendo la concentración de calcio intracelular en enterocitos.

DISEÑO DEL EXPERIMENTO

• Determinación de la absorción de calcio

Para determinar la cantidad de calcio absorbido por los enterocitos se utilizó FLUO-4, que es un indicador permeable de calcio que permite cuantificar la concentración de calcio citosólico por fluorescencia.

Cuando FLUO-4 atraviesa la membrana celular, es metabolizado por estearasas, generando Fluo-4/Ca2+, que no puede atravesar la membrana de nuevo.

La línea celular utilizada en el ensayo fue IPEC-J2, que es una línea no transformada, proviene de tejido intestinal de lechón y se utiliza en modelo para estudios con desafíos.

Los enterocitos de cultivaron hasta obtener confluencia (2-3 días, 80-90% crecimiento celular) en placas especiales para evaluar la fluorescencia.

• Tratamientos celulares

Se establecieron 5 lotes o tratamientos: tres con diferentes concentraciones de Alquernat Magacal, un control negativo y un control positivo con carbacol, molécula que incrementa la movilización intracelular de calcio. Cada tratamiento se distribuyó en 12 pocillos: 6 con fosfato cálcico 2 mM y 6 con EGTA 1mM.

Grupo 4 y 5 se usan como grupos control. Se toma grupo 4 como control negativo, sin ningún tipo de tratamiento. Y al grupo control positivo se le añade carbacol, que es una sustancia que incrementa la movilización intracelular de calcio.

• Tratamientos con Fluo-4

Tras la incubación con Alquernat Magacal, las células se lavaron y se añadió Fluo-4.

Se incubaron los pocillos en un ambiente oscuro durante 1 hora y se determinó la fluorescencia, que indicará la concentración de calcio absorbido por el enterocito.

RESULTADOS

En la gráfica superior podemos observar los niveles de fluorescencia que se determinaron tras la incubación con Alquernat Magacal. Las barras de color azul indican nivel de fluorescencia por presencia de calcio absorbido en del medio. El color rosa EGTA expresa el nivel de calcio citosólico en las células donde no se ha adicionado calcio al medio. Es decir, este representa el calcio basal.

Hay una relación entre la concentración de Alquernat Magacal y nivel de fluorescencia, o lo que es lo mismo, concentración de calcio citosólico.

En el lote o tratamiento 3, donde la concentración es mayor, se evidencia una mayor diferencia entre calcio absorbido del medio y calcio basal y por lo tanto una mayor capacidad de absorción.

CONCLUSIONES

Este ensayo indica que Alquernat Magacal incrementa la concentración intracelular de calcio mediante el incremento de la absorción en enterocitos.

Se observa una mayor eficacia (incremento de absorción de calcio significativa) utilizando una dilución 1:100 de los principios activos.

Esto significa que Alquernat Magacal ayuda a obtener la cantidad adecuada de calcio, importante en múltiples funciones, incluyendo la formación de la cáscara y del hueso.

Enzimas digestivas en peces

Este artículo recoge la conferencia impartida por el Ing. Alfredo R. Palomino de la Universidad Científica del Sur, (Lima, Perú), en el XXXI Simposium Internacional de Biovet en Tarragona, durante la cuarta sesión dedicada a las enzimas y los captadores de micotoxinas, que tuvo lugar el día 29 de mayo de 2018. Bajo el título, “Enzimas digestivas en peces” la conferencia desgranó los diferentes tipos de digestiones que presentan los peces (dependiendo de su especie) y analizó el papel que juegan las enzimas en la digestión. El veterinario del equipo de Biovet S.A, Dr. Antón Tallero, ha realizado la adaptación de la ponencia.

INTRODUCCIÓN

La habilidad de un organismo para digerir partículas de alimento depende de la presencia y de la cantidad apropiada de enzimas digestivas (Smith, 1980).

La digestión del alimento en el tracto digestivo de peces teleósteos se lleva a cabo a través de enzimas, como en el resto de los animales de producción, aunque estas van a variar por las diferencias fisiológicas, anatómicas y etológicas de estos animales acuáticos.

DIGESTIÓN GÁSTRICA

La digestión comienza en el estómago, ya que los peces teleósteos no poseen glándulas salivales como los mamíferos o las aves. Por lo tanto, la boca del pez tiene una mera función mecánica y de aprehensión en la digestión de alimentos.

Figura 1. Anatomía del aparato digestivo en peces teleósteos

Dentro de los peces, se diferencian los que realizan una digestión gástrica e intestinal, y los que no poseen un estómago propiamente dicho y son capaces de llevar a cabo una primera digestión en el esófago. Un ejemplo de este fenómeno fisiológico es la especie Neogobius gymnotrachelus, pez agástrico.

La falta de estómago no es infrecuente entre los peces teleósteos, pero nuestra comprensión de esta especialización reductiva es aún escasa. La ausencia de un estómago no restringe la preferencia trófica, lo que resulta en peces con una morfología alimentaria muy similar capaz de digerir dietas diferentes.

Así pues, dentro del estómago se distinguen la digestión proteolítica y no proteolítica:

• Digestión proteolítica

Ocurre a pH muy ácido gracias a la concentración de ácido clorhídrico y su valor óptimo para la digestión de proteínas varía en distintas especies. El bajo nivel de pH activa el pepsinógeno que es el precursor de la pepsina, enzima encargada de hidrolizar proteínas en el estómago. La cantidad de pepsina secretada al tubo digestivo está regulada por el tenor proteico de las dietas.

La pepsina da lugar a grandes fragmentos proteicos y algunos aminoácidos libres que pasarán al intestino, donde luego serán absorbidos.

• Digestión no proteolítica

En ciertos peces puede darse otro tipo de digestión proteolítica, como la digestión de la quitina. La quitina es un carbohidrato estructural que da forma al exoesqueleto de los crustáceos, entre otras especies marinas.

La quitinasa es, por lo tanto, enzima puede digerir el principal componente del exoesqueleto de los crustáceos, para facilitar una posterior digestión intestinal y evitar así posibles obstrucciones en el tracto gastrointestinal.

Otro tipo de enzima que digiere carbohidratos estructurales es la celulasa, presente en estómagos de peces con alimentación herbívora.

DIGESTIÓN INTESTINAL

La digestión de carbohidratos, lípidos y proteínas continua en el intestino. La mayor parte de enzimas digestivas provienen del páncreas, que pasan desde este órgano al tubo digestivo por el conducto pancreático.

• Digestión pancreática

Tiene lugar a pH neutro o básico, gracias a la secreción de bicarbonato (jugo biliar que proviene de la vesícula biliar y pancreático). Las principales enzimas que entran en juego son:

• Endopeptidasas: Tripsina y quimotripsina. Hidrolizan proteínas y polipéptidos.
• Endopeptidasas: Elastasa I y II. Digieren elastina y otras proteínas estructurales.
• Exopeptidasas: carboxipeptidasa A y B: cortan uniones terminales de proteínas y polipéptidos.

En los peces agástricos se inicia la hidrólisis de proteínas por la tripsina pancreática.

En cuanto a la digestión de grasas, las enzimas pancreáticas que actúan son:

• Lipasa pancreática: forma activa y única. Efectúa la hidrólisis o rotura de triglicéridos ingeridos en la dieta en monoglicéridos y ácidos grasos libres. Para que ello sea posible, las sales biliares actúan emulsionando las grasas y creando gotas más pequeñas que facilitan la acción de la lipasa.
• Lipasa no específica: digieren lípidos neutros, ésteres de colesterol y ceras.

Por último, las enzimas encargadas de hidrolizar los carbohidratos complejos y que se excretan por el páncreas son las glucosidasas:

• Amilasa pancreática: se encargan de hidrolizar glucógeno y almidón.
• Quitinasa: quitina (exoesqueleto artrópodos)

Figura 2. El exoesqueleto de los crustáceos se digiere gracias a la quitinasa

• Digestión en ciegos pilóricos

No se observa en todas las especies y el papel fisiológico de esos divertículos queda aún como objeto de discusión. Dentro de ellos se ha encontrado actividad tipo tripsina en especies de atún, Sebastis maurins, Salmón chinook y trucha arcoiris. Actividad polipeptidásica también ha sido evidenciada.

Figura 3 Ciegos pilóricos

Existe una acción complementaria entre la tripsina y la polipeptidasa de los ciegos pilóricos, permitiendo llegar a los aminoácidos libres para su absorción en pared intestinal.

• Digestión intestinal proteolítica

Existen otras enzimas proteolíticas en intestino que colaboran en la digestión. Estas se encuentran en las membranas celulares de las células de la pared intestinal. Las características de estas peptidasas de membrana son:

• Son substancias activadoras de coenzimas pancreáticas
• Se trata de amino, di y tripeptidasas en el citoplasma de los enterocitos
• Hacen posible la absorción de aminoácidos libres o pequeños péptidos (2 a 6 aminoácidos)

En los peces agástricos es aquí donde se completa la hidrólisis de proteína (carboxipolipeptidasa y leucina aminopeptidasa)

ABSORCIÓN Y TRANSPORTE DE NUTRIENTES

La absorción de aminoácidos y péptidos de cadena corta se lleva a cabo por los enterocitos de dos formas distintas:  Difusión simple y facilitada; y transporte activo.

Para que ocurra la absorción de las grasas, se han de formar micelas mixtas -producto de digestión de los lípidos- que son insolubles en agua, que pueden ponerse en contacto con las microvellosidades del intestino delgado y absorberse en la membrana celular por difusión.

Una vez en el interior de los enterocitos, los productos de la digestión de los lípidos se unen a una proteína, la cual los lleva hasta el retículo endoplasmático liso. En éste tiene lugar la resíntesis de triglicéridos, lecitinas y colesterol esterificado.

Los diferentes lípidos se agrupan posteriormente y se rodean de una cubierta de lipoproteínas, dando lugar a la aparición de los quilomicrones. Su composición sería: 87% de triglicéridos, 9% de fosfolípidos y colesterol libre, 3% colesterol esterificado y 1% de vitaminas liposolubles y proteínas.

Los quilomicrones pasan posteriormente al sistema linfático.

Y, por último, en cuanto a los azúcares: fructosa, galactosa y glucosa, resultantes de la digestión de carbohidratos complejos en el lumen intestinal, atraviesan el enterocito por difusión facilitada o cotransporte para llegar al torrente sanguíneo.

CONCLUSIONES

La concentración de todas estas enzimas varía dependiendo de los hábitos alimentarios de los peces.

Peces especializados en una dieta concreta presentan diferencias significantes en tipo, concentración y actividad enzimática, pudiendo no existir determinadas enzimas o tener una actividad muy reducida

Peces especializados, que se alimentan con diferentes tipos de dietas, se puede encontrar mayor diversidad de enzimas.

Es importante conocer los hábitos digestivos y características del tracto digestivo, ya que esto nos permite formular dietas adecuadas para un óptimo desarrollo de los peces y a su vez nos ayudará a elegir ingredientes funcionales que podrían incorporarse en la dieta.